mRNA疗法正逐渐成为许多疾病的重要治疗方法。在治疗过程中，将mRNA注射到患者体内，编码体内相应的蛋白质。为此，生产的mRNA产品需要具有高纯度和安全保证。
mRNA在体内的持续时间通常很短，包括加工、翻译、然后降解。通常需要进行修饰以增强稳定性，包括骨架修饰、糖修饰或碱基修饰，此外，还包括N(5')-末端带“帽”或C(3')-末端带“尾”、“ cap" "通常是7-甲基鸟苷，它在真核细胞中的作用是耐受核酸酶。“尾巴”通常包括一个多聚腺苷酸化，在mRNA的3'末端添加一个多聚腺苷酸基序，其作用是避免核酸外切酶降解。
mRNA 可以通过体外转录 (IVT) 合成。它需要一个线性或环状 DNA 模板，其中包含启动子、三磷酸核糖核苷、包含 DTT 和镁的缓冲系统以及合适的 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6 RNA）。聚合酶）、DNAse I、焦磷酸酶和/或 RNAse 抑制剂。体外合成的mRNA长度通常为1-5kb。
传统的RNA纯化方法多采用吸附柱，操作时使用乙醇等腐蚀性或易燃溶剂。在处理管理和规模化生产中应尽量避免这种情况。此外，这种方法不能有效地分离出不完整的转录本，即“未成熟”的RNA序列，也称为“shortmers”，其长度通常小于所需的转录本。这些杂质 RNA 是高度免疫刺激剂，当存在时，它们可以极大地改变 mRNA 作为活性药物成分 (API) 的毒性和耐受特性。
切向流过滤技术可有效用于体外合成mRNA的纯化，有效去除反应底物、酶、副产物，特别是反应液中的“短链”，同时保持mRNA的完整性，切向流过滤只需要使用 水性缓冲液用作溶剂，不需要腐蚀性或易燃溶剂。此外，该方法符合药品生产管理的要求。因此，切向流过滤是一种更有效、可靠和安全的 mRNA 纯化方法，适用于大规模治疗应用。
mRNA纯化工艺步骤包括： a) 将体外合成的mRNA反应混合物置于变性条件下（如加入变性剂：尿素、氯化钾、硫氰酸胍、SDS、孵育）； b) 使用切向流过滤从混合物中纯化 mRNA。
纯化后的产品不应含有未成熟的 RNA 序列和体外合成过程中使用的酶试剂（包括 T7 RNA 聚合酶、DNAse I、焦磷酸酶和 RNAse 抑制剂）。一般来说，“未成熟”的RNA序列应该小于5%到检测不到，或者小于15个碱基，纯化后mRNA的完整性需要>95%到100%。
切向流过滤采用KrosFlo开发的IIi切向流过滤系统，配备MidiKros 500kD 115cm^2 mPES中空纤维过滤模块，循环流速~130mL/min，对应剪切速率~5000S-1。
实验首先测试了体外合成的5mg萤火虫荧光素酶mRNA的处理，反应液总体积为2.24mL，5M尿素为变性剂，室温孵育5min，转移至TFF样品容器中，NFW稀释至 200mL 和 1200mL NFW 进行超滤冲洗。然后，用 200 mL 10 mM 柠檬酸钠处理，并用 600 mL NFW 切向流恒体积冲洗。***超滤浓缩至~2mL，260nm处测定浓度，转染HEK293T细胞。培养后，检测细胞裂解液中的 FFL。
